– PRÁCTICA 20 – GALERÍA API

1.FUNDAMENTO

• Se trata de una opción muy utilizada para identificación de las distintas bacterias estudiadas
• Son sistemas o equipos multipruebas, consistente en dispositivos con entre 10-50 pocillos,y en cada uno de éstos se desarrolla una prueba bioquímica distinta, lo cual permite realizar a la vez entre 10-50 pruebas.
• Los resultados de las pruebas se expresan de forma numérica, siguiendo las instrucciones, obteniendo al final un código numérico
• Utilizando este código numérico, identificaremos a la bacteria.

2.OBJETIVO

• El objetivo de esta práctica es la identificación de la bacteria por medio de distintas pruebas bioquímicas realizadas al mismo tiempo, debido a que cada uno de los pocillos contienen un sustrato específico para esa prueba

3.MATERIALES

• Papel de filtro
• Guantes
• Suero fisiológico (SSF)
• Mechero Bunsen
• Asa de platino
• Muestra , con la colonia bacteriana en estudio
• Placa API
• Estufa
• Parafina

4. PROCEDIMIENTO

• Realizamos una dilución de la muestra con SSF,  por lo que depositamos en un tubo 2 ml de SSF y un par de colonias de la muestra en estudio,hasta conseguir la turbidez 0,5 McFarland.
• Una vez tenemos la dilución hecha,depositamos 20 microlitros en cada uno de los pocillos de la placa API
• Cuando hemos depositado toda la muestra en los distintos pocillos, debemos añadir gotas de parafina a aquellos pocillos que están indicados son un subrayado.
• Una vez finalizado este proceso, colocamos la placa API en un soporte con papel de filtro húmedo,con agua destilada, evitando la desecación de la prueba.
• Tapamos la placa API

• Incubamos 24 horas – 35-37 ºC
• Transcurrido este tiempo en la estufa, procedemos a identificar las reacciones  bioquímicas producidas en cada pocillo, determinando características distintas de la bacteria en estudio (Ejemplo: ureasa, glucosa…)
• Anotamos en una ficha el resultado de cada uno de los pocillos, positivo o negativo
•  Seguidamente, para cada grupo de tres pruebas, se suma el valor asignado a los positivos

-Con todas las cifras resultantes, obtenemos un código

-La documentación que acompaña al test relaciona esos códigos con la identificación de la bacteria determinada.

 

5. RESULTADOS

– PRÁCTICA 19 – SIEMBRA EN AGAR HIERRO DE KLIGLER (KIA)

1.FUNDAMENTO

• Se trata de una siembra en picadura
• Es una prueba combinada usada para la diferenciación de enterobacterias , permitiendo determinar :

-Capacidad de un microorganismo de metabolizar glucosa/lactosa

-Producción o no de gas, como producto final del metabolismo de los carbohidratos

-Producción ácido sulfhídrico, con un color negro en el inferior del tubo

2. COMPOSICIÓN

• Glucosa, lactosa (Carbohidratos)
• Indicador Rojo Fenol,que vira a amarillo en medio ácido.
• Sales de hierro y tiosufalto de sodio, sustrato necesario para la producción de ácido sulfhídrico.

3. PROCEDIMIENTO

• Sembrar el medio mediante picadura , picado en el fondo y extendiendo por agotamiento la superficie restante del medio

• Incubar durante 24 horas, a 35-37 ºC. en condiciones de anaerobiosis
• Efectuar lectura

-Pico rojo/fondo amarillo ——–Fermenta glucosa

-Pico amarillo/fondo amarillo —— Fermenta glucosa/lactosa

-Pico rojo / fondo rojo ——-No fermenta azúcares

-Presencia de burbujas o ruptura del medio —– Produce gas

-Ennegrecimiento del fondo ——Produce ácido sulfhídrico

 

  4. RESULTADOS

• No son fiables nuestros resultados debido a que han pasado 48 horas, y el medio puede virar el color sin significar que fermente o no los distintos azúcares.

• Aunque no son fiables, diríamos que :

-Fondo amarillo/pico rojo ——————-Fermenta solamente la glucosa

-Fondo amarillo / pico amarillo ————– Fermenta lactosa/glucosa

– PRÁCTICA 18- PRUEBA IMVIC

 

 

1.FUNDAMENTO

• Se trata de un conjunto de cuatro pruebas bioquímicas,empleadas fundamentalmente para la identificación de enterobacterias.
• Consta de :

-Prueba de Indol

-Prueba de Rojo Metilo

-Prueba de Voyes-Proskauer

-Prueba de Citrato

• Cada una de ellas nos da una característica determinada de la bacteria en estudio, indicadas para enterobacterias.

 

PRUEBA DE INDOL

1. FUNDAMENTO

• Se trata de una prueba en la que determinamos si la bacteria es capaz de desgrada el triptófano, dando lugar a Indol.
• Si degrada este Aminoácido, nos indicará que produce la enzima triptofanasa.
• Utilizamos como medio Agua de Peptona, y un reactivo que reacciona con el indol, formando un compuesto de color rojo intenso —-Reactivo de Kovac

    2.  OBJETIVO

• El objetivo de esta práctica es determinar si la bacteria produce la enzima triptofanasa

3. MATERIALES

• Papel de filtro
• Guantes
• Tubo con medio Agua de Peptona
• Mechero Bunsen
• Reactivo de Kovac
• Muestra con las bacterias 5 /11
• Estufa

4. PROCEDIMIENTO

• Preparamos el banco de trabajo con todo lo necesario para la práctica
• Inocular una o dos colonias en el medio Caldo de Peptona, e incubar durante 24-48 horas a 35-37 ºC
• Añadir 5 gotas de Reactivo de Kovac al caldo de cultivo

cof

cof

• Efectuar lectura

-Indol + —————Banda de color rosa intenso o rojo-violeta en la superficie

-Indol –  ————-Banda de color amarillo en la superficie del caldo de cultivo

5. RESULTADOS

• Ambas bacterias han resultado con una banda de color amarillo en su superficie

cof

cof

 

6. INTERPRETACIÓN RESULTADOS

• Tanto la bacteria 5 como la 11 nos ha dado negativo, apareciendo una banda de color amarillo en la superficie del caldo de cultivo

 

PRUEBA ROJO METILO

1. FUNDAMENTO

• Se trata de una prueba para determinar la capacidad de una bacteria de fermentar glucosa por la vía ácido-mixta, con producción de ácido
• Para detectar si se han producido ácidos utilizamos como indicador de pH el rojo de metilo, que actúa entre pH 4,2 (rojo) y pH  6,3 (amarillo)

  2. OBJETIVO

• El objetivo de esta práctica es determinar si el metabolismo de la glucosa utilizado por la bacteria es del tipo ácido – mixta.

    3. MATERIALES

• Papel de filtro
• Guantes
• Tubo con medio MRVP
• Muestra con las colonias bacterianas
• Mechero Bunsen
• Asa de platino
• Reactivo Rojo Metilo
• Estufa

   4. PROCEDIMIENTO

• Preparar el banco de trabajo con todo el material necesario
• Suspender un inóculo en el medio de cultivo MRVP, y mezclar por rotación
• Incubar durante 24-48 horas a 35-37 ºC
• Una vez incubados, añadir 5 gotas de solución indicadora de Rojo de Metilo, y mezclamos por rotación

cof

• Efectuamos la lectura

-Medio de color rojizo (ácido)   —— Metilo positiva (+)

-Medio de color amarillo (básico) ——- Metilo negativa (-)

-Suele realizarse la lectura a las 48 horas para evitar falsos positivos , pudiendo encontrar el cultivo en un punto en el que esté produciendo ácido pero para otros fines

  5.  RESULTADOS

• Ambas bacterias nos han resultado con el medio de color amarillo

cof

 

  6.  INTERPRETACIÓN RESULTADOS

• Las dos bacterias en estudio nos han resultado Metilo negativas (-) , al aparecer un medio de color amarillento, y no rojizo.
• Ésto indica que las bacterias no fermentan la glucosa por vía ácido -mixta

 

 

PRUEBA VOYES-PROSKAUER

1. FUNDAMENTO

• Esta prueba consiste en determinar la capacidad de la bacteria de fermentar la glucosa por vía butanodiólica
• En el caso que utilice esta vía, produce un compuesto intermedio propio de esta fermentación, la Acetoína, la cual va a reaccionar con el reactivo utilizado (alfa-naftol)
• Medio utilizado es —- MRVP

       2.  OBJETIVO

• El objetivo de esta práctica es determinar si nuestras bacterias en estudio fermentan la glucosa por vía butanodiólica.

      3. MATERIALES

• Papel de filtro
• Guantes
• Tubos con medio MRVP
• Mechero Bunsen
• Asa de Platino
• Muestra, con las colonias bacterianas en estudio
• Reactivos alfa- naftol / KOH
• Estufa

 4. PROCEDIMIENTO

• Preparamos el banco de trabajo con todo el material necesario
• Suspendemos un inóculo en el medio de cultivo MRVP, que es un medio líquido que contiene Glucosa
• Mezclamos por rotación
• Incubar durante 24-48 horas, a 35-37ºC
• Añadir 12 gotas del reactivo alfa-naftol al 5% en etanol (VPB—NARANJA), y añadir 4 gotas de KOH al 40% ( VPA——-BLANCO)

cof

cof

cof

cof

• Agitar por rotación
• Dejar medios abiertos e inclinados, porque el oxígeno es importante para la reacción

-Precaución , evitando derrames

• Efectuar lectura a los 5-10 minutos

-Medio color rosado ——–  Voyes-Proskauer positiva (+), con presencia de Acetoína

-Medio de color amarillo —– Voyes-Proskauer negativa (-), sin presencia de Acetoína

 

       5.  RESULTADOS

• Ambas bacterias nos resultan con un medio de color amarillento al efectuar la lectura

cof

cof

       6. INTERPRETACIÓN RESULTADOS

• Ambas bacterias han dado negativo en esta prueba, por lo que podemos concluir que no fermentan la glucosa por vía butanodiólica.

 

PRUEBA UTILIZACIÓN CITRATO

1. FUNDAMENTO

• Es una prueba que consiste en valorar si una bacteria es capaz de utilizar citrato como única fuente de carbono, y compuestos amoniacales como única fuente de nitrógeno en su metabolismo.
• Se realiza en el medio Agar Citrato de Simmons, que contiene citrato sódico y azul bromotimol, como indicador de pH

        2. OBJETIVO

• El objetivo de esta práctica es determinar si la unica fuente de carbono de la bacteria es el citrato, y como única fuente de nitrógeno, los compuestos amoniacales.

       3. MATERIALES

• Papel de filtro
• Guantes
• Tubo con medio Citrato de Simmons
• Mechero Bunsen
• Asa de platino
• Muestra, con las colonias bacterianas en estudio
• Estufa

       4. PROCEDIMIENTO

• Preparamos el banco de trabajo con todo el material necesario
• Realizamos una siembra por agotamiento en la superficie del agar inclinado
• Incubar durante 24-48 horas a 35-37 ºC
• Efectuamos lectura

-Color del medio azul intenso ——– Citrato positiva (+)

-Color del medio azul grisáceo o sin cambio de color ——- Citrato negativa (-)

• Es muy importante utilizar un control negativo para poder comparar los medio ante casos de duda en el viraje del color

• Es importante tener en cuenta que pasadas 24 horas los resultados son menos fiables, ya que el color del medio tiende a virar a un color azulado transcurrido este tiempo

          5.  RESULTADOS

• Los resultados obtenidos de ambas bacterias es un medio sin cambio de color aparente, y no pudiendo valorarlo con certeza debido a que han pasado más de 48 horas

           6. INTERPRETACIÓN RESULTADOS

• Ambas bacterias resultan citrato negativas, por lo tanto no utilizan el citrato como única fuente de carbono, ni los compuestos amoniacales como única fuente de nitrógeno.

 

 

• En todas las practicas bioquímicas descritas en la Prueba IMVIC, solamente es necesario utilizar el Mechero Bunsen a la hora de realizar la siembra

• Cuando procedemos a la utilización de reactivos y lectura no es necesario

– PRÁCTICA 17- PRUEBA COAGULASA

1.FUNDAMENTO

• La coagulasa es una enzima que convierte el fibrinógeno en fibrina
• Esta práctica permite determinar la capacidad de la bacteria de coagular el plasma por la acción de la coagulasa
• Es muy utilizado para diferenciar Staphylococcus aureus (Coagulasa +) de otras especies de Staphylococcus (Coagulasa -)

2.OBJETIVO

•  El objetivo de esta práctica es determinar si la bacteria en estudio sintetiza la enzima coagulasa

3.MATERIALES

• Papel de filtro
• Guantes
• Gradilla
• Tubo de hemólisis
• Mechero Bunsen
• Asa de Platino
• Baño de agua

4.PROCEDIMIENTO

• Preparar el banco de trabajo con el material necesario para realizar la práctica
• Procedemos a incorporar una muestra del cultivo a un tubo que contenga 0,5 ml de plasma
  

  cof

  

  cof

  

  cof

  

  cof
• Mezclamos por rotación, sin agitar
• Una vez se encuentra homogeneizado la colonia bacteriana-plasma, incubamos a 35-37ºC

cof

sdr

-Vamos observando cada cierto tiempo si se ha formado un coágulo, en el caso contrario, lo dejamos en el baño de agua hasta 4 horas

• Pasado este tiempo, si no se ha formado coágulo se considera negativa

• El resultado se valora con el tubo inclinado

 

5.RESULTADO

• Bacteria 5 estudiada , no forma coágulo visible
• Bacteria 11 estudiada, si forma coágulo visible en el tubo

6.INTERPRETACIÓN RESULTADOS

• Una vez observados los resultados, podemos determinar que :

-La bacteria 5, es coagulasa negativa (-), por lo que no sintetiza la enzima coagulasa

-La bacteria 11, es coagulada positiva(+), por lo que sintetiza la enzima coagulasa, capaz de convertir el fibrinógeno en fibrina.

– PRÁCTICA 16- PRUEBA POTASA

1.FUNDAMENTO

• Se trata de una Técnica de Screening, para determinar si una bacteria es gram + o gram –
• También se le llama «Técnica de la cuerda», debido a que el fenómeno que podemos observar en el caso de que la bacteria estudiada sea gram – es un hilo o cuerda.
• Utilizamos hidróxido de potasio (KOH), cuya concentración disgrega la membrana de las bacterias gram -, rompiendo su pared y saliendo hacia el exterior todo su contenido celular, mezclándose todos los componentes, incluso proteínas desnaturalizadas.
• Debido a esto, se forma ese «hilo o cuerda» de aspecto mucoide.

2.OBJETIVO

• El objetivo de esta práctica es determinar si la bacteria estudiada es gram –

3. MATERIALES

• Papel de filtro
• Guantes
• Portaobjetos
• Asa de platino
• Mechero Bunsen
• Hidróxido de potasio (KOH)
• Muestra : Bacteria 5 /  11

 

4.PROCEDIMIENTO

• Preparar el banco de trabajo con todos los materiales necesarios
• Preparamos una solución de hidróxido de potasio (KOH) al 3%

-Para ello, sabemos que el KOH se encuentra al 90%

-Para conseguir una concentración de 3%, cogemos 3,33 g KOH (pastillas), en un Matraz de 100 ml

• Una vez preparada la DL de KOH al 3% , echamos una gota de KOH en el porta

cof

cof

cof

• Homogeneizamos, al añadir la muestra con nuestras colonias bacterianas en estudio

cof

cof

• Observar si se crea el aspecto mucoide y una «cuerda», característico de las bacterias gram –

5. RESULTADOS

• Los resultados no son válidos, debido a que no se ha formado en ninguno de los dos casos un aspecto mucoide con forma de cuerda o hilo
• Sabemos que no es válido porque la Bacteria 5 es gram – , comprobada anteriormente con la tinción de gram.

– PRÁCTICA 15- PRUEBA OXIDASA

1.FUNDAMENTO

• La citocromooxidasa es una enzima que en presencia de oxígeno oxida la fenilendiamina y forma indofenol (compuesto color violeta)
• Consiste en poner la colonia en contacto con fenilendiamina para saber si la bacteria sintetiza esta enzima, manifestándose con un cambio de color (azul-violáceo)
• El reactivo no se encuentra en solución, sino en tiras de papel absorbente con una zona reactiva.
• Es una técnica útil para diferenciar entre Streptococcus y Staphylococcus

 

2.OBJETIVO

• El objetivo de esta práctica es determinar si la bacteria en estudio produce la enzima citocromooxidasa.

3.MATERIALES

• Papel de filtro
• Guantes
• Tira reactiva
• Colonia bacteriana de interés
• Mechero Bunsen

 

4.PROCEDIMIENTO

• Preparamos el banco de trabajo con todo el material necesario
• Cogemos una tira reactiva que contiene el reactivo fenilendiamina para saber si reacciona y se encuentra la enzima que buscamos
• Cogemos una colonia de la bacteria en estudio , y frotar la colonia sobre la zona reactiva con ayuda del Asa de platino

dav

dav

-Es importante utilizar un cultivo fresco/puro  para realizar esta técnica, 18 h)

• Esperar 10-30 segundos, y efectuar la lectura:

-Zona reacción color azul-violeta ( Oxidasa +)

-Zona reacción color rosado o sin cambio de color (Oxidasa -)

-Es importante que pasado este tiempo consideremos la prueba negativa, al poder influir el oxígeno de la atmósfera en la reacción, ya que es una condición indispensable para esta técnica

5.RESULTADO

• La bacteria 5 , que es sobre la que hemos realizado el estudio, no forma ningún producto coloreado

6.INTERPRETACIÓN

• La bacteria estudiada no produce color, por lo tanto no produce la enzima citocromooxidasa.

 

– PRÁCTICA 14- PRUEBA CATALASA

      1. FUNDAMENTO

• La catalasa hidroliza el peróxido de hidrógeno en agua y oxígeno gaseoso, que se libera formando burbujas
• La mayoría de las bacterias aerobias y anaerobias facultativas sintetizan esta enzima

– A excepción de Streptococcus spp y Enterococcus spp

• La prueba consiste en añadir peróxido de hidrógeno a una colonia bacteriana, y observan si se forman burbujas, procedentes de los productos formados en la reacción

2.OBJETIVO

• El objetivo de esta práctica es determinar si la bacteria en estudio sintetiza la enzima catalasa, pudiendo orientarnos con esta y otras muchas características  de que especie se trata.

3. MATERIALES

• Papel de filtro
• Guantes
• Portaobjetos
• Mechero Bunsen
• Asa de platino
• Bacterias en estudio
• Agua oxigenada (Peróxido de hidrógeno)

4. PROCEDIMIENTO

• Preparamos el banco de trabajo con todo el material necesario para la práctica

dav

dav

• Depositamos una gota de peróxido de hidrógeno en un porta/tubo

dav

dav

• Procedemos a tomar una colonia de la bacteria en estudio, en condiciones de esterilidad, y la homogeneizamos junto a la gota de peróxido de hidrógeno depositada anteriormente.

dav

dav

dav

dav

-Es importante utilizar cultivos jóvenes y puros (24 h), debido a que las bacterias solamente pueden producir la enzima catalasa si son viables.

-Se puede realizar tanto en portaobjetos como en tubo

• Esperemos 15-20 segundos, y efectuamos la lectura:

-Catalasa Positiva (+) ——– Se forman burbujas

-Catalasa Negativa (-) ——- No se forman burbujas

5.RESULTADOS

• La bacteria 5, realizada en tubo, nos da catalasa positiva
• La bacteria 11, realizada en portaobjetos, da catalasa negativa

 

6. INTERPRETACIÓN RESULTADOS

• Según los resultados obtenidos, la Bacteria 5 si sintetiza la enzima Catalasa, mientras que la Bacteria 11 no sintetiza esta enzima.

– PRÁCTICA 13- SIEMBRA EN DISTINTOS MEDIOS DE CULTIVO

Siembra en Agar Sangre

• Es un medio enriquecido y diferencial
• Utilizado para la investigación de los distintos tipos de hemólisis

-Alfa-hemólisis ————-Hemólisis parcial, con un color verdoso (Streptococcus pneumoniae)

-Beta – hemólisis (piogénicos)  ———— Hemólisis total (Streptococcus pyogenes,               S. agalactiae)

-Gamma – hemólisis ————– no hay hemólisis (Streptococcus mutans)

• Crecen las bacterias gram + , sobretodo Streptococcus y Staphylococcus
• Composición: Agar columbia + 5% de sangre de cordero
• Es uno de los medios más utilizados como medio básico de aislamiento para la siembra inicial de la mayor parte de las muestras, excepto de orinas

 

dav

cof

Siembra en Agar McConkey

• Es un medio selectivo y diferencial, para la detección de enterobacterias en muestras de origen diverso.
• Contiene sales biliares y cristal violeta para inhibir el crecimiento de las bacterias gram +
• Está indicado para bacterias gram –
• Incluye además un indicador que permite detectar la fermentación de la lactosa:

-Las colonias lactosa – , son incoloras

-Las colonias lactosa +, son de color rojo ladrillo, rodeadas de un halo de sales biliares precipitadas

Siembra en Levine (EMB)

• Medio de cultivo sólido para bacterias aerobias
• Es un medio de cultivo selectivo y diferencial para el aislamiento de enterobacterias
• Se compone de eosina y azul de metileno, que inhibe el desarrollo de microorganismo gram +  ,permitiendo diferenciar bacterias fermentadoras y no fermentadoras de lactosa.
• En este medio es muy característico el crecimiento de la bacteria Escherichia coli (E.coli), con un color verde metálico brillante

Siembra en Mueller-Hinton

• Es un medio enriquecido
• Recomendado universalmente para realizar pruebas de sensibilidad a los antimicrobianos (Antibiograma)

• Se trata de una base excelente para suplementarla con sangre y obtener medios de Agar sangre para cultivo,y aislamiento de microorganismos nutricionalmente exigentes.
• 

Caldo Agua de Peptona

• Medio utilizado para el preenriqueciemiento de microorganismos a partir de distintas muestras, en particular productos alimentarios.

 

Medio Citrato Simmons

• Medio utilizado para la diferenciación de enterobacterias, en base a la capacidad de usar citrato como única fuente de carbono y energía.

• En el medio de cultivo, el fosfato monoamónico es la única fuente de nitrógeno y el citrato de sodio es la única fuente de carbono. Ambos componentes son necesarios para el desarrollo bacteriano.

• Las sales de fosfato forman un sistema buffer, el magnesio es cofactor enzimático.

• El cloruro de sodio mantiene el balance osmótico, y el azul de bromotimol es el indicador de pH, que vira al color azul en medio alcalino.

 

Medio Clarks y Lubs (MRVP)

• Medio particularmente útil para la clasificación de enterobacterias

 

– PRÁCTICA 12- ANTIBIOGRAMA

     1. FUNDAMENTO 

• El estudio de la sensibilidad in vitro es uno de los requisitos previos para la eficacia in vivo de un tratamiento antibiótico.
• También es importante para realizar estudios sobre la evolución de las resistencias bacterianas que permite revisar los protocolos de la antibioticoterapia empírica.
• La determinación de la Concentración Mínima Inhibidora  (CMI)
  • – Es la medida de la sensibilidad de una bacteria a un antibiótico.
  • Es la mínima cantidad de antimicrobiano  capaz de impedir el crecimiento de un microorganismo en unas condiciones normalizadas.
  • Es el método habitual utilizado en los laboratorios de Microbiología Clínica
    

    2.  OBJETIVO

•  El objetivo de esta práctica es determinar el nivel de sensibilidad de una cepa bacteriana frente a un grupo de antibióticos
• Conocer el concepto de cepa sensible y resistente.
• Entender el concepto de halo de inhibición.

3.  MATERIALES NECESARIOS

Papel de filtro

-Guantes

-Asa de Digralsky

-Pipetas Automáticas/ puntas estériles

-Contenedor residuos biológicos

-Discos con los distintos antibióticos

-Pinzas

-Alcohol

-Mechero Bunsen

-Regla milimetrada

-Suero fisiológico

-Asa platino

4. PROCEDIMIENTO

• Primeramente, preparamos el banco de trabajo con todo el material necesario para nuestra práctica
• Procedemos a preparar un tubo con una turbidez 0,5 McFarland, teniendo que poner 5 ml SSF y 3-4 colonias de la bacteria estudiada.

• Una vez hemos conseguido esta turbidez, dispensamos en la placa de Mueller Hinton 100 microlitros de la muestra, con ayuda de una micropipeta

• Esterilizamos el Asa de Digralsky, con ayuda de Etanol y el Mechero Bunsen, y hacemos una siembra en césped, por toda la superficie del cultivo

-Dejamos secar durante 5 minutos para que impregne toda la placa

-Esterilizamos de nuevo el Asa de Digralsky, que contiene bacterias procedentes de nuestra muestra

• Con ayuda de unas pinzas, previamente esterilizadas de la misma forma que el Asa de Digralsky, colocamos los distintos discos de antibióticos en la placa, aplicando un poco de presión para que contacte bien con el agar

 

-Es IMPORTANTE esterilizar la pinza cada vez que pongamos un disco de antibiótico nuevo

• Esperamos 15 minutos, para que el antibiótico difunda por la placa
• Incubamos 18 h – 35º
• Transcurrido este tiempo, se realiza la lectura del Antibiograma, pudiendo decir si la bacteria estudiada es resistente o sensible a dichos antibióticos.

 

• Siembra en césped,  medio Mueller-Hinton

 

5. RESULTADOS

• La bacteria número  5, presenta resistencia ante el antibiótico Azlocillin, sensibilidad media ante Colistín, y es sensible ante Amikacin y Amoxicilina con Ácido Clavulánico.

 

• La bacteria número 11 presenta resistencia ante Azlocillin, Colistin y Amoxicilina con Ácido Clavulánico, y es sensible al Amikacin.

6.INTERPRETACIÓN RESULTADOS

• Hemos podido saber si las distintas bacterias son resistentes o sensibles a los antibióticos estudiados debido a que según el diámetro del halo formado se consideran útiles o insuficiente como tratamiento para dichas bacterias.
• De forma general , se consideran:

– Con una diámetro de inhibición de 30-35 mm, correspondería a una cepa altamente sensible al antibiótico.

-Con una diámetro de inhibición menor de 15 mm, corresponden a cepas resistentes.

– PRÁCTICA 11- ESCALA DE MCFARLAND

1.FUNDAMENTO 

• Los estándares de McFarland son patrones de turbidez basados en suspensiones de sulfato de bario.
• Cada patrón se prepara mezclando

– Ácido sulfúrico al 1%

-Cloruro de bario al 1,175%

• Para estimar la densidad bacteriana de una suspensión, se compara visualmente en turbidez con la de los patrones de McFarland.

 2.OBJETIVO

• El objetivo de esta práctica es preparar 11 patrones, con una turbidez desde 0,5 hasta 10, posteriormente comparable a una suspensión bacteriana con una densidad determinada.

3.MATERIALES

• Papel de Filtro
• Gradilla
• Guantes
• Mechero Bunsen
• Tubos
• Asa de siembra
• Medio Mueller Hinton
• Suero fisiológico (SSF)
• Cloruro de bario y ácido sulfúrico

4.PROCEDIMIENTO

• Preparamos el banco de trabajo, con todo el material necesario para la práctica

• Primeramente, necesitamos preparar las disoluciones de H2SO4 y BaCl2.

  -Para ello, utilizaremos un matraz de 500ml y otro de 50ml.

• El H2SO4 lo necesitaremos al 1%, por tanto,teniendo  que poner 5ml de H2SO4 y 495ml de agua destilada.
  

  
•  

   

  -Es importante que echemos antes un poco de agua, ya que si no el ácido puede saltar y quemarnos.

• Para el BaCl2, que lo queremos al 1,175%,utilizamos un matraz de 50ml, teniendo que pesar 0,5875 gramos de BaCl2, y enrasar el matraz con agua destilada.

• Una vez tengamos preparados los matraces con las distintas disoluciones, rotulamos cada tubo, correspondiendo a su turbidez determinada
• Calcularemos la cantidad de Cloruro de bario y Ácido sulfúrico necesario para alcanzar la turbidez deseada en cada tubo.
• Según éstos cálculos, prepararemos los distintos tubos, alcanzando la turbidez deseada   
  

  

• Procedemos a tapar los tubos y homogeneizamos.
• Una vez los tenemos todos preparados, ponemos un fondo negro o un fondo con franjas negras horizontales, de contraste.

– Así, podremos ver los distintos grados de turbidez alcanzados, y posteriormente compararlos con las suspensiones bacterianas de interés.

 

 

 

5.LECTURA RESULTADOS

• Como resultado de esta práctica obtenemos 11 patrones distintos con distinto grado de turbidez

6. INTERPRETACIÓN RESULTADOS

• Esta serie de patrones obtenidos nos servirán para realizar posteriores comparaciones con distintas suspensiones bacterianas con distinta densidad/turbidez
• Mediante esta comparación sabremos el numero de bacterias existente en una suspensión bacteriana en función de la turbidez que presenten.